Принципы лабораторной диагностики вирусных гепатитов

Принципы лабораторной диагностики вирусных гепатитов

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

ЗАНЯТИЕ № 31 ТЕМА: ГЕПАТОТРОПНЫЕ ВИРУСЫ

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

  1. Вирусные гепатиты A, B, C, D, E, G. Этиология. Сравнительная характеристика основных биологических свойств возбудителей вирусных гепатитов.

  2. Вирус гепатита А. Структура и свойства HAV. Пути проникновения и циркуляция в организме. Патогенез, клиника, исход заболевания. Лабораторная диагностика гепатита А. Иммунитет, специфическая профилактика, лечение.

  3. Вирус гепатита E. Структура вируса. Эпидемиология, клинические формы, исход заболевания. Вирусологическая и серологическая диагностика.

  4. Гепаднавирусы. Морфология, особенности репродукции вируса гепатита В. Структура генома, антигены, полипептидные фрагменты HBs-Ag, подтипы вируса.

  5. Гепатит В: эпидемиология, патогенез, клинические формы течения заболевания, исходы. Лабораторная диагностика. Иммунитет, специфическая профилактика, лечение.

  6. Гепатит D. Особенности строения вируса. Характеристика заболевания: коинфекция, суперинфекция. Лабораторная диагностика, профилактика.

  7. Гепатит С: классификация вируса, ультраструктура, антигены. Общая характеристика заболевания, исходы заболевания. Диагностика гепатита C: скрининговые методы, подтверждающие тесты.

  8. Гепатит G: возбудитель, вирусологическая диагностика. Посттрансфузионный гепатит TTV: характеристика вируса, вирусологическая диагностика.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Лабораторная диагностика гепатита А (инкубационный период 14-45 дней)

Исследуемый материал:кровь (сыворотка), фекалии, вода и пищевые продукты

Выявление антигена (реакции)ИФА — антиген вируса (HAVAg) выявляют в экстрактах фекалий со 2-й недели и до конца болезни;

Выявление вируса (методы) Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), в научных и производственных целях используют заражение обезьян и культур клеток

Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РИА IgM 4-8 недели, IgG с 4 недели, остаются на всю жизнь

Генодиагностика (сроки, реакции) ПЦР — РНК вируса (HAV RNA)

Динамика появления серологических маркеров гепатита А

Оценка результатов серологического исследования

1.Антиген HAV обнаруживается в конце инкубационного, весь продромальный период, но при манифестации инфекции с появлением желтухи исчезает (показатель заразности инфекции!).

2.Основным диагностическим критерием текущей или свежеперенесенной инфекции являются антитела класса IgM (показатель заразности инфекции!).

3.Антитела класса IgG появляются на поздних стадиях заболевания, сохраняются в течение длительного времени и свидетельствуют о перенесенном заболевании.

Лабораторная диагностика гепатита В (инкубационный период 2- 6 месяцев)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Выявление антигенов (очередность, сроки, длительность) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют поверхностный антиген HВsAg 1-5 месяцев, “антиген инфекционности” HBеAg 2-3 месяца; HBс Ag в крови не циркулирует в свободном виде, его можно обнаружить только в биоптатах печени- в ядрах гепатоцитов

Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют: антитела к поверхностному антигену (анти-HВsAg)- с 6 месяцев; антитела к “антигену инфекционности” анти-HВеAg с 4-5 месяцев). Антитела к сердцевинному антигену (анти-HВсAg IgM и антиHВcAg IgG) служат индикатором вирусемии и могут определяться в гепатоцитах методом РИФ с 2 месяцев;

Генодиагностика.Выявление НК (сроки, реакции) ДНК (HBV DNA вируса в крови и биоптатах печени с момента заражения до выздоровления (в среднем 6 месяцев) методом ПЦР и молекулярной гибридизации

Динамика появления серологических маркеров гепатита В

Оценка результатов серологического исследования

1. HBsAg выявляется в крови в последние дни инкубационного периода, достигает максимальных концентраций в период острых клинических проявлений (желтуха, повышение уровней АлАТ, АсАТ, билирубина и др.). В большинстве случаев HBsAg исчезает в течении 3-5 недель от начала заболевания. Персистенция HBsAg (>6 месяцев) – предиктор хронизации гепатита.

2. HBeAg выявляют при ОГВ в течение 6-8 недель. Более длительная его персистенция указывает на хронизацию инфекции.

3. Присутствие анти-НВe класса IgM достоверно свидетельствует об остром гепатите В

4. Антитела к HBe обнаруживаются после появления анти — НВс класса IgM и исчезают в течение года у 50% пациентов.

5. Анти-HBs-антитела можно выявить через 1-3 месяца после исчезновения HBs-антигена. Они присутствуют в крови в течение 4-5 лет.

Интерпретация результатов серологического обследования на гепатит В

Серологический диагноз

HBsAg

Анти-HBs

анти-НВс суммарные

HBеAg

Анти-HBе

ДНК ВГВ, копий/мл

HBc IgМ

HBc IgG

Острый гепатит В

+/–

–/+

+

+

+/–

–/+

+/–

Хронический интегративный ГВ (носительство HBsAg)

+

+

+

<105

Хронический репликативный ГВ

+

+/–

+

+/–*

–/+*

>105

Иммунитет после вакцинации

+

Иммунитет после перенесенного ГВ

+

+

+/–

Лабораторная диагностика гепатитов C, D, E

Гепатит С (инкубационный период 2 недели -3месяца)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Скрининговые тесты: выявление в донорской крови антител к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5) вируса тест-системами третьего поколения ИФА-3,

Подтверждающие тесты в образцах с первично положительным результатом ИФА проводят:

  1. ИФА с раздельным определением антител к различным белкам вируса,

  2. иммуноблоттинг с использованием рекомбинантных антигенов к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5).

Оценка результатов иммуноблотанализа положительный при выявлении антител к двум и более АГ

Генодиагностика РНК вируса (HCV RNA) методом ПЦР и молекулярной гибридизации на протяжении болезни

D (инкубационный период 2 недели -6 месяцев)

Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

Выявление антигенов (антигены, реакции) ИФА, РИА, иммуноблотинг — антиген вируса (HDVAg)

Выявление антител (реакции) Сыворотка крови ИФА — анти-HDV IgM, анти-HDV IgG.

Генодиагностика ПЦР, метод молекулярной гибридизации — РНК вируса (HDV RNA

Гепатит Е (инкубационный период 14-45 дней)

Исследуемый материал: кровь (сыворотка), фекалии, вода и пищевые продукты

Выявление антигена (реакции) ИФА — антиген вируса (HЕVAg),

Выявление вируса (методы) Иммунная электронная микроскопия( ИЭМ),

Выявление антител ИФА — анти-HЕV IgM в начале заболевания , анти-HЕV IgG после заболевания)

Генодиагностика сыворотка крови, кал обнаружение РНК вируса (HEV RNA) в ПЦР на протяжении болезни

Гепатиты

А (HAV)

B (HBV)

С (НСV)

D (HDV)

Е (НЕV)

G (HGV)

Таксономия возбудителя

Сем. Picornaviridae

Род. Hepatovirus

Сем. Hepadnaviridae

Род. Ortohepadnavirus

Сем. Flaviviridae

Род. Hepacivirus

Неклассифицирован, вирус-сателлит (вироид) HBV

Сем. Hepeviridae

Род. Hepavirus

Сем. Flaviviridae

неклассифицирован,

Морфология (форма, размер, наличие суперкапсида)

простой вирус, капсид икосаэдр

25-30 нм

сложный вирус сферической и палочковидной формы

42 нм

сложный вирус сферической формы

55-65 нм

сложный вирус сферической формы

35-40 нм.

простой вирус икосаэдр

27-34нм

сложный вирус сферической формы

60 нм

Геном

+ РHK, линейная, нефрагментированная

ДНК кольцевая, двунитевая с однонитевым участком

+ РHK, линейная, нефрагментированная

— РHK, кольцевая

+ РHK, линейная, нефрагментированная

+ РHK, линейная, нефрагментрованная

Пути передачи

Фекально-оральный

Парентеральный

Парентеральный

Парентеральный

Фекально-оральный

Парентеральный

Инкубацион-ный период

14-45 дней

2- 6 месяцев

14 дней — 3 месяца

2 — 6 месяцев

14-45 дней

14 дней — 6 месяцев

Клинические проявления

Острые гепатиты

Часто хронический гепатит, цирроз, нередко рак

Часто хронический гепатит, цирроз, часто рак

Часто хронический гепатит, цирроз, нередко рак

Острые гепатиты, тяжело протекают у беременных

Часто хронический гепатит

Специфичес-кая профилак-тика

Инактивированная культуральная по эпид. с 3 лет, ревакцинация через 4 года

Рекомбинантная, плановая с 1996 года. 12час, 1месяц,3 месяца ревакцинация через 5 лет

Нет

Вакцина против гепатита В из-за общности поверхностного HBsAg

Инактивированная культуральная по эпид. с 3 лет.

Нет

Исследуемый материал

сыворотка крови, фекалии, вода и пищевые продукты.

сыворотка крови, биоптаты печени

сыворотка крови, биоптаты печени

сыворотка крови, биоптаты печени

сыворотка крови, фекалии, вода и пищевые продукты

сыворотка крови, биоптаты печени

Маркеры

HAV РНК, HAV Ag, anti-HAV IgM, IgG

HBV ДНК, HBsAg, HBeAg, anti-HBsAg, anti-HBeAg, anti-HBc IgM, IgG

HCV РНК, anti-HCV IgM, anti-HCV IgG

HDV РНК, HDAg, anti-HDV IgM, IgG

HEV PНК, HEV Ag, anti-HEV IgM, IgG,

HGV РНК, anti-HGV

Экспрессдиагностика

1) ПЦР — РНК вируса (HAVRNA) выявляют в сыворотке крови, фекалиях, воде и пищевых продуктах.

2) ИФА — антиген вируса (HAVAg) выявляют в экстрактах фекалий;

3) Иммунная электрон-ная микроскопия (ИЭМ).

1) ПЦР, метод молекулярной гибридизации — ДНК вируса (HBV DNA) в крови, биоптатах печени.

2) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют антигены вируса : поверхностный антиген (HВsAg), “антиген инфекционности” (HВеAg);

ПЦР, метод молекулярной гибридизации в сыворотке крови — РНК вируса (HCV RNA) 2)

1) ПЦР, и метод молекулярной гибридизации — РНК вируса (HDV RNA) ;

2) ИФА, РИА, иммуноблотинг антиген вируса (HDV Ag) .

1) ПЦРобнаружение РНК вируса (HEV RNA) всыворотке крови, испражнениях

2) ИФА — антиген вируса (HЕVAg),

ПЦРс предварительным этапом обратной транскрипции(RT-PCR) обнаружение РНК вируса (HGV RNA) ;

Вирусологичес-кие методы

Заражение клеточных культур, обезьян (шимпанзе) только для научных и производственных целей, в диагностике не применяют

Заражение обезьян (шимпанзе) только для научных целей, в диагностике не применяют

Нет

Нет

Нет

Нет

Серологическаядиагностика

ИФА, РИА в сыворотке крови выявляют Ig M-антитела (анти-HAV IgM) и Ig G-антитела (анти-HAV IgG).

ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют противовирусные антитела: антитела к поверхностному антигену (анти-HВsAg); антитела к сердцевинному антигену (анти-HВсAg IgM, IgG; антитела к “антигену инфекционности” (анти-HВеAg);

ИФА, в сыворотке антитела к вирусу (анти-HCV IgM, анти-HCV IgG)

В донорской крови

1) ИФА с раздельным определением антител к различным белкам вируса,

2) иммуноблоттинг с рекомбинантными антигенами к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5) для выявления антител.

ИФА в сыворотке крови — антитела к вирусу (анти-HDV IgM, анти-HDV IgG).

ИФА в сыворотке крови — антитела к вирусу (анти-HЕV IgM, анти-HЕV IgG

ИФА в сыворотке крови — антитела против вирусного белка Е2 (анти-HGV Е2)

Иммуноблоттингметод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Полоски с “блотами” антигенов выпускаются различными фирмами. 1. На эти полоски наносят сыворотку больного. 2. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. 3. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител

Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется “венчик“ из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами хорошо видимый в электронном микроскопе.

Радиоиммунный анализ (РИА), — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген — антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации, т. е . увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя . Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материал а, денатурируют ( «расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити . В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно по вторяется при заданных температурных режимах . Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам прай меров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3′- концам ДНК искомого гена), ДНК — полимеразы и нуклеотидов. Для амплификации РНК вирусов применяют ПЦР с предварительным этапом обратной транскрипции (RT-PCR).



Источник: studfile.net


Добавить комментарий