Модель вируса гепатита с

Модель вируса гепатита с

— [ Страница 1 ] —

Л.И. Николаева

ВИРУС ГЕПАТИТА С:

антигены вируса и реакция

на них иммунной системы

макроорганизма

Информационно-методическое пособие

Новосибирск

УДК 616.36-002.14:578.891]-078.33

Вирус гепатита С: антигены вируса и реакция на них иммунной системы макроорганизма:

информационно-методическое пособие / Л.И. Николаева.

– Новосибирск : «Вектор-Бест», 2009. 78 с.

В пособии изложены современные представления о молекулярной биологии вируса гепатита С (ВГС), его антигенах и иммунной защите макроорганизма при инфицировании этим вирусом. Рассмотрены различия в специфическом гуморальном иммунитете у людей при остром и хроническом гепатите С, закономерности изменения в содержании антивирусных иммуноглобулинов при естественно текущей острой и хронической инфекции, а также особенности специфического гуморального иммунитета у детей, имеющих маркёры ВГС-инфекции.

Пособие предназначено для сотрудников биологических и медицинских научно-исследовательских институтов, для работников лечебно-диагностических центров и слушателей факультетов постдипломной подготовки врачей.

Л.И. Николаева – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Издается в авторской редакции.

© Николаева Л.И., 2009 © ЗАО «Вектор-Бест», 2009

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ако – аминокислотный(-ые) остаток(-тки) АлАТ – аланинаминотрансфераза АПК – антигенпредставляющие клетки АсАТ – аспартатаминотрансфераза ВГС – вирус гепатита С ГС – гепатит С ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВПЧ – вирусоподобные частицы ГВР – гипервариабельный регион ИЛ – интерлейкин ИФН – интерферон кДа – килодальтон ЛНП – липопротеины низкой плотности ЛОНП – липопротеины очень низкой плотности МКА – моноклональные антитела MHC – главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex) НТО – нетранслируемая область ОГС – острый гепатит С ОТ-ПЦР – обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция ПВЧ – псевдовирусные частицы ПЦР – полимеразная цепная реакция ХГС – хронический гепатит С ТХЛ – Т-хелперные лимфоциты ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты ЭПР – эндоплазматический ретирулум

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С

1.1. Организация генома вируса

1.2. Строение вириона

Глава 2. ОСНОВНЫЕ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА С.

….. 15

2.1. Структура, функции и эпитопы оболочечных гликопротеинов

2.2. Нуклеокапсидный антиген

2.3. Характеристика белка NS2

2.4. Структура, функции и эпитопы протеина NS3……………..

2.5. Полипептиды NS4a и NS4b и их детерминанты…………… 35

2.6. Биологическое значение и эпитопы белков NS5a и NS5b

Глава 3. РОЛЬ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ОГРАНИЧЕНИИ ВГС-ИНФЕКЦИИ

3.1. Основные факторы иммунной системы, влияющие на элиминацию вируса в острой фазе инфекции……………. _

3.2. Роль Т-клеточного ответа при гепатите С

3.3. Гуморальный ответ на антигены вируса гепатита С…….. 49 3.3.1. Специфические антитела в острой фазе инфекции…….. _ 3.3.2. Специфический гуморальный иммунитет при естественном течении хронического гепатита С….. 55 3.3.3. ВГС-специфический гуморальный иммунитет у людей, перенесших острую инфекцию с выздоровлением

3.3.4. Специфический гуморальный иммунитет у детей с маркёрами ВГС-инфекции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в Российской Федерации, как и в большинстве стран, отмечается неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по парентеральным вирусным гепатитам [1–3]. Ожидается, что к 2015–2020 гг. численность инфицированных людей во всем мире удвоится [2, 3]. Начиная с 2001 г. в нашей стране наблюдается тенденция к снижению показателей заболеваемости острым гепатитом С (ОГС) [1, 4]. После 2004 г. началось снижение показателей выявления людей с хроническим гепатитом С (ХГС) [5, 6].

Однако среди детей до 2006 г. регистрировался рост численности больных ХГС [1, 5, 6]. По оценкам экспертов, 1,4–2,4% граждан Российской Федерации инфицированы вирусом гепатита С (ВГС), причем большинство этих людей уже имеет хроническую форму инфекции [7, 8]. Для ХГС характерно прогрессирующее течение, приводящее к формированию цирроза печени (до 30%), первичной гепатоклеточной карциномы (до 15%) и внепеченочным проявлениям (до 74%) [9, 10].

Несмотря на интенсивное изучение ВГС-инфекции, до сих пор не удалось установить причину частого развития хронической формы инфекции, выявить особенности иммунного ответа, обуславливающие естественную элиминацию вируса в острой фазе инфекции, а также создать профилактическую вакцину. Известно, что антигены ВГС способны индуцировать В- и Т-клеточный ответ, который у 15–25% людей с острым гепатитом С достаточен для элиминации вируса [2, 11]. Но чаще всего острая фаза инфекции переходит в хроническую форму на фоне более или менее выраженного адаптивного иммунного ответа [12, 13].

Вирус гепатита С – уникальный патоген, который способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые генетические и антигенные варианты, задерживать формирование Т-хелперного и Т-киллерного ответа при остром гепатите С и вызывать повторную инфекцию у выздоровевших людей. Интенсивное изучение ВГС-инфекции началось после идентификации ее возбудителя в 1989 г. и в первую очередь преследовало главную цель – создание профилактической вакцины [14, 15]. К концу 1990-х годов после неудачных попыток разработки такой вакцины на основе рекомбинантных оболочечных белков ВГС основное внимание в изучении противовирусного иммунитета было обращено на специфический Т-клеточный ответ.

Необходимо отметить, что изучение защитных иммунных механизмов при гепатите С во многом сдерживается отсутствием доступной лабораторной модели инфекции, вирус поражает только людей и шимпанзе. Но, как показали А. Basset и соавторы, у шимпанзе, инфицированных вирусом, течение инфекции имеет более легкую форму, а выздоровление происходит чаще, чем у людей [16].

В настоящем пособии обобщены современные данные об антигенах ВГС и рассмотрены возможности иммунной защиты человеческого организма при этой инфекции. Особое внимание уделено специфическому гуморальному ответу, поскольку именно он выпал из области интенсивного изучения. Как отмечают зарубежные исследователи, это связано в основном с отсутствием доступных методов анализа антител на раздельные (индивидуальные) антигены ВГС [17]. В нашей стране с 1998 г. выпускаются иммуноферментные тест-системы для анализа иммуноглобулинов к отдельным антигенам ВГС, что позволило отечественным специалистам получить ценную информацию относительно особенностей гуморального ответа на вирусные белки.

6 Глава 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С

1.1. Организация генома вируса В 1989–1990 гг., благодаря развитию молекулярно-генетических методов, стало возможным клонирование и выделение генома ВГС, а затем и самого вируса, существование которого было предсказано ранее [14, 15, 18, 19]. Особенности организации генома ВГС позволили включить его в семейство Flaviviridae в новый род Hepacivirus, членами которого позже стали и другие вирусы [15, 20, 21]. Геном ВГС представлен однонитевой РНК, имеющей положительную полярность, и содержит около 9400–9600 нуклеотидных остатков. Для него характерны: уникальная открытая рамка считывания, короткие 5- и 3-концевые нетранслируемые области (НТО) и участки с высокой частотой мутаций [21, 22].

Открытая рамка считывания кодирует единственный белокпредшественник, называемый полипротеином, который состоит из 3008–3037 аминокислотных остатков (ако) [23]. В результате ко- и посттрансляционного протеолитического расщепления полипротеина и процессинга продуктов образуются структурные и неструктурные белки. Схема расположения вирусных антигенов в полипротеине, участки действия протеаз и степень гомологичности между различными изолятами вируса представлена на рис. 1 [24].

Из-за генетического разнообразия ВГС в начале 1990-х годов возникли сложности с классификацией его изолятов. В 1994 году на II Международной конференции по вирусу гепатита С и родственным вирусам было принято соглашение положить в основу классификации вируса область генома, кодирующую белок NS5b [25]. В результате было выделено 6 генотипов и около 80 подтипов ВГС.

– &nbsp– &nbsp–

(5-НТО) * (3-НТО) 92% 81% 55% 65% 57% 70% 65% 66% 70% 26% Рис. 1. Схема расположения вирусных антигенов в полипротеине [24]. Сайты действия клеточных протеаз отмечены стрелками сверху, для сериновой протеазы ВГС – снизу. Участок, расщепляемый вирусной протеазой NS2/NS3, выделен звездочкой.

Внизу указан процент гомологичности между изолятами вируса с учетом НТО.

Основные генотипы гомологичны на 65–70%, подтипы (субтипы) – на 77–80%, а генетические варианты в пределах одного изолята – на 95–97%. Позднее, в 2005 г., группой экспертов были внесены уточнения в классификацию ВГС [26]. Рекомендуется сохранить термин «генотип» вместо предложенного некоторыми исследователями «клайда». При типировании изолятов вируса следует анализировать область генома core/E1, NS5b и определять нуклеотидную последовательность всей РНК вируса, если есть подозрение на рекомбинацию [27]. Предложено все известные к настоящему времени изоляты ВГС классифицировать на шесть генотипов, а введенные некоторыми исследователями генотипы 7–10 рассматривать как подтипы.

Наиболее консервативным участком РНК ВГС является 5-концевая НТО – около 92% гомологии [22]. Благодаря этому консервативному участку стало возможным обнаружение вирусной РНК в разных изолятах методом ОТ-ПЦР (обратной транскрипцииполимеразной цепной реакции) [28, 29]. В инфицированном организме ВГС существует в виде набора генетически разнородных, но близких вариантов, названных квазивидами, различия в нуклеотидной последовательности которых составляют несколько процентов [30].

В течение инфекционного процесса вирус подвергается иммунному прессу: одни варианты ВГС удаляются иммунной системой хозяина, а другие возникают [31, 32]. Новые варианты вируса появляются из-за отсутствия у РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС, корректирующей 3-5-экзонуклеазной активности [33]. Поэтому ошибки, возникающие в процессе репликации вирусной РНК, не устраняются.

Большинство изменений в нуклеотидной последовательности РНК ВГС встречается в так называемых синонимических сайтах, мутации в которых не влияют на биологически важные свойства вируса. Сравнение синонимических сайтов позволяет установить дивергенцию сопоставляемых вариантов вируса. Так, при изучении изолятов ВГС, выделенных на различных территориях, было установлено, что проникновение вируса в человеческую популяцию, вероятно, произошло около тысячи лет назад [34, 35].

Первый элемент генома ВГС, 5-концевая НТО, состоит из 341 нуклеотидного остатка и выполняет важные биологические функции. Эта область обеспечивает взаимодействие вирусной РНК с 40S субъединицей рибосомы, формируя сложный по структуре участок связывания, называемый в английской аббревиатуре IRES (internal ribosome entry site) [36]. IRES ВГС имеет сложное пространственное строение (рис. 2) [37, 38].

– &nbsp– &nbsp–

–2

–100 460–

– 480 60– 140– 440– 5 –500

– &nbsp– &nbsp–

– 420 }2 340– 400–

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 2. Схема вторичной структуры IRES с четырьмя основными доменами (I–IV), псевдоузлом, основным (1) и дополнительным (2) кодонами дана с легкими изменениями из статьи D.M. Forton и соавторов [38].

После связывания IRES ВГС с 40S субъединицей рибосомы начинается формирование активного трансляционного комплекса и трансляция вирусного генома по кэп-независимому механизму [37, 39]. Для инициации трансляции используется кодон AUG в позиции 342 (рис. 2). Установлено, что при взаимодействии РНК вируса и 40S субъединицы рибосомы в последней происходят сложные конформационные изменения, что является уникальным процессом [40].

Для трансляции генома ВГС необходимы обычные (канонические) клеточные факторы инициации eIF2 и eIF3. Поскольку активный трансляционный комплекс формируется медленно, начальная скорость трансляции невысока, но она возрастает при взаимодействии плюс-цепи РНК с неканоническими активаторными белками клетки, такими как антиген La, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L, рибосомальный белок rpS5 и еще несколько неидентифицированных клеточных белков [41–44].

Способность IRES ВГС связываться с рибосомой могут ингибировать некоторые клеточные белки, пептиды и витамин В12 [45–49].

Комплиментарные участкам IRES короткие РНК, называемые короткими интерферирующими РНК, связываясь с ним, останавливают трансляцию генома вируса [50]. Показано, что антивирусный эффект альфа-, бета- и гамма-интерферонов также проявляется на уровне IRES-опосредованной трансляции [51]. Обнаружено, что у ВГС есть тканеспецифические различия в структуре IRES [38, 52, 53]. Возможно, что это один из способов, обеспечивающих персистенцию вируса в клетках многих тканей.

В процессе репликации генома ВГС образуется РНК с отрицательной полярностью, называемая минус-цепью РНК. Она нестабильна, расщепляется клеточными ферментами (за 30 мин почти на 60%) [54]. В инфицированной клетке соотношение плюс- и минусцепей РНК составляет 10:1 [55]. Для эффективной репликации вирусного генома необходим клеточный белок РТВ (polypyrimidine tract-binding protein), связывающий полипиримидиновый тракт РНК [56]. В модельных экспериментах установлено, что в одной инфицированной клетке в сутки образуются около 1000 копий плюс-цепей РНК и около 100 копий минус-цепей РНК [57].

Заключительный элемент генома – 3-концевая НТО – участвует в инициации репликации (сайт инициации находится в минусцепи РНК), в регуляции трансляции и стабилизации геномной РНК [41, 59–61]. В структуре 3-концевой НТО выделяют три элемента:

1) короткий участок с вариабельной последовательностью, состоящий из 40 нуклеотидных остатков, 2) полиуридиновый тракт, содержащий 36 и более остатков уридина, и 3) уникальный консервативный регион Х, состоящий из 98 нуклеотидов [60]. Регион Х имеет сложную вторичную структуру, в которой выделяют одну длинную и две короткие шпильки [61]. Установлено, что этот регион принимает непосредственное участие в формировании репликативного комплекса, регуляции инициации трансляции и репликации [41, 62, 63].

1.2. Строение вириона В ранних экспериментах при фильтрации ВГС через фильтры с разным диаметром пор было показано, что вирион имеет размер от 30 до 60 нм, что совпадало с данными электронно-микроскопического анализа вируса в биологических образцах [64, 65]. В начале 1990-х годов из сыворотки крови людей, больных гепатитом С, были выделены РНК-содержащие частицы, которые при градиентном ультрацентрифугировании концентрировались в пяти зонах в интервале плотности 0,95–1,21 г/мл [66–68]. Каждая из этих зон была использована для заражения шимпанзе [68]. И оказалось, что максимальной инфекционностью обладала зона с плотностью 0,95–1,10 г/мл. Такая необычно низкая плотность вирусных частиц объясняется ассоциацией ВГС с сывороточными липопротеинами низкой плотности (ЛНП) и очень низкой плотности (ЛОНП) [19, 66].

Липопротеины представляют собой сферические частицы, сформированные монослоем фосфолипидов с включениями холестерина и аполипопротеинов В и Е, внутренняя полость частиц заполнена триглицеридами [69]. Основная функция липопротеинов – доставка триглицеридов и холестерина различным клеткам. Синтез липопротеинов происходит в эндоплазматическом ретирулуме (ЭПР) гепатоцитов, где они, предположительно, взаимодействуют с белковолипидной оболочкой ВГС, образуя комплекс [70]. Участки оболочки ВГС, ответственные за образование комплекса вируса с ЛНП/ЛОНП, пока не установлены. Этот комплекс называют липовирусными частицами. Вирионы в составе комплекса защищены от вируснейтрализующих антител и могут проникать в гепатоциты при помощи рецептора для ЛНП [68]. Около 75% липопротеинов, циркулирующих в крови, возвращаются в гепатоциты через специальный рецептор для ЛНП; остальные попадают в гепатоциты иначе. Установлено, что около 20% вирионов не ассоциированы с сывороточными липопротеинами [71].

Исследуя устойчивость ВГС к органическим растворителям, A.M. Prince и соавторы показали, что вирус имеет липидно-белковую оболочку, которая сформирована липидами клетки-хозяина и поверхностными белками вируса [72]. В последующие годы строение ВГС было уточнено с помощью высокоразрешающего электронномикроскопического анализа биоптатов печени больных гепатитом С и искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ). ВПЧ формируются после экспрессии фрагмента генома ВГС (называемого репликоном) в различных векторах. В качестве векторов были использованы вирусы везикулярного стоматита, осповакцины и бакуловирус [73–75]. При включении в геном ретровируса (ВИЧ или вируса лейкоза мышей) нуклеотидной последовательности, кодирующей оболочечные белки ВГС, удалось получить псевдовирусные частицы (ПВЧ), в оболочке которых содержались белки Е1 и Е2 от ВГС, а все остальные элементы частицы были ретровирусными [76, 77]. Применение ВПЧ облегчило изучение морфологии и сборки ВГС, а также исследование свойств его белков. В частности, были уточнены размеры вириона, диаметр которого составил 50 нм, что соответствует современным данным, полученным при исследовании нативного вируса, выделенного от больных гепатитом С [78, 79].

На рис. 3 представлена электронная микрофотография ВПЧ, полученная с помощью трансмиссионного электронного микроскопа [79].

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 3. Электронная микрофотография с негативным контрастированием ВПЧ [79].

Внизу слева с более сильным увеличением показан единичный вирион с Т-образно выступающими поверхностными белками.

Под оболочкой ВГС располагается нуклеокапсид, который сформирован сердцевинным (core) белком и содержит вирусную РНК (рис. 4). Размеры нуклеокапсида, как установлено при помощи электронно-микроскопического анализа вирусных частиц с неоформленной оболочкой, составляют 33–40 нм [74].

До настоящего времени выделить ВГС в количестве, достаточном для его детального изучения, ни от больных людей, ни от шимпанзе не удалось. Это связано с низким содержанием вируса, его гетерогенностью, а также способностью образовывать комплексы с антителами и липопротеинами крови. Первое сообщение о культивировании ВГС на перевиваемых клеточных культурах было сделано П.Г. Дерябиным и соавторами в 1997 г. [81]. В 2005 г. четыре группы исследователей опубликовали экспериментальные данные об экспрессии вируса в перевиваемых культурах клеток с продукцией инфекционных вирусных частиц [82–85].

Mорфогенез ВГС осуществляется в мембранах эндоплазматического ретирулума, вакуолях аппарата Гольджи и цитоплазме клетки. Структурные белки вируса отщепляются от полипротеина с помощью клеточных ферментов (сигнальных пептидаз и пептидпептидаз). Сердцевинный белок остается на цитоплазматической поверхности ЭПР и в липидных вакуолях цитоплазмы, а оболочечные белки частично проникают во внутреннюю полость ЭПР.

– &nbsp– &nbsp–

В эндоплазматической сети белки Е1 и Е2 формируют комплекс и подвергаются процессингу, который, вероятно, заканчивается в секреторных вакуолях аппарата Гольджи. Нуклеокапсид после упаковки РНК покрывается оболочкой, и вирус выпочковывается в цистерны ЭПР. На основании результатов анализа биоптатов печени больных ХГС V. Falcon и соавторы предположили, что заключительные этапы морфогенеза вируса происходят в ЭПР-подобных везикулярных структурах цитоплазмы [86]. Сформировавшиеся вирусные частицы покидают клетку в составе секреторных вакуолей [87].

Скорость образования вирионов у пациентов с хронической ВГСинфекцией может достигать 1012 частиц в сутки, а период полужизни вирионов в крови составляет около 3 ч [88].

Глава 2. ОСНОВНЫЕ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА С Мажорными протеинами ВГС являются оболочечные белки Е1 и Е2, нуклеокапсидный и неструктурные белки NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b.

Кроме них с вирусного генома транслируются еще минорные полипептиды: пептид р7, белок F и мало изученный полипептид с молекулярной массой около 8 кДa [89].


Два последних минорных протеина синтезируются в результате считывания генетической информации с дополнительных инициирующих кодонов, локализованных в области генома, кодирующей сердцевинный белок [22]. Установлено, что мало изученный полипептид с молекулярной массой около 8 кДa считывается с кодона 2 (см. рис. 2). Схема расположения белков ВГС в мембране ЭПР представлена на рис. 5.

Пептид р7, называемый также виропорином ВГС, образует гептамеры, формирующие катион-специфический канал, значение которого в биологии вируса пока полностью не выяснено [91]. Предполагается, что он принимает участие в ранних этапах морфогенеза вируса. Недавно показано влияние пептида р7 на инфекционные свойства ВГС [92].

Белок F синтезируется при сдвиге рамки считывания генетического кода на один нуклеотидный остаток (новый инициирующий кодон начинается с 341-го нуклеотидного остатка, см. рис. 2) и имеет

– &nbsp– &nbsp–

Полость ЭПР Рис. 5. Схема расположения белков ВГС в мембране ЭПР дана с легкими изменениями из статьи B. Lindenbach и C.M. Rice [90].

консервативную аминокислотную последовательность [93, 94]. Выдвинута гипотеза об участии этого белка в развитии персистентной ВГСинфекции [94, 95]. Возможно, существует связь между появлением белка F и стеатозом печени при хроническом гепатите С. Показано, что антитела к этому белку обнаруживаются лишь у 10% больных ХГС, однако в случае развития у них стеатоза печени частота выявления этих антител возрастает в три раза [96]. В настоящее время ведется интенсивное изучение биологических функций минорных белков ВГС.

2.1. Структура, функции и эпитопы оболочечных гликопротеинов Оболочечные белки Е1 (ако 192–383) и Е2 (ако 384–746) являются фрагментами полипротеина, которые расположены за сердцевинным (core) белком (см. рис. 1) [97, 98]. По данным электрофоретического анализа, молекулярная масса протеина Е1 составляет 31 кДа, Е2 – 70 кДа. Оба белка относятся к трансмембранным протеинам и содержат углеводные остатки [97]. Основные функции этих белков

– взаимодействие с рецепторами и обеспечение проникновения вирусного генома в цитоплазму клетки.

Биосинтез белков ВГС осуществляется на рибосомах, ассоциированных с ЭПР. Благодаря специальному сигналу транслокации большая часть участка полипротеина, соответствующего белкам E1 и E2, попадает в полость цистерн ЭПР. Там клеточные сигнальные пептидазы отщепляют эти протеины друг от друга, а также от сердцевинного белка [62, 97–99]. (Сайты действия пептидаз показаны на рис. 1.) После этого оболочечные белки ВГС остаются связанными с мембранами ЭПР за счет трансмембранных участков, локализованных в СООН-концевых участках их полипептидных цепей [99, 100].

Сложный процесс пространственной укладки, или фолдинга, белков E1 и E2 начинается одновременно с трансляцией и завершается после нее. Основные этапы фолдинга протеина E1 осуществляются в течение 1 ч с помощью клеточного белка-шаперона калнексина, образующего с ним кратковременный комплекс [101, 102]. С участием калнексина из восьми цистеиновых остатков гликопротеина Е1 образуются четыре дисульфидные (S-S) связи. В течение еще одного часа пространственная структура гликопротеина Е1 стабилизируется [103].

Фолдинг белка Е2 более длительный (около 4 ч), чем у протеина Е1.

Очевидно, это обусловлено наличием в молекуле 18–20 цистеиновых остатков, которые могут образовать 9–10 дисульфидных связей, и интенсивным гликозилированием белка Е2 [104]. Пространственная укладка протеина Е2 происходит при участии калнексина и еще не идентифицированных шаперонов, а также белка Е1 [103, 104].

Предполагают, что при ее завершении в белке Е2 образуются 8–9 дисульфидных связей в пределах одного полипептида и одна S-Sсвязь между двумя полипептидами Е2–Е2.

Комплекс оболочечных белков Е1–Е2 формируется без возникновения ковалентных связей [103–105]. Стехиометрия этого комплекса пока не установлена, вероятно, преобладающим компонентом является белок Е2 [104]. Не всегда укладка белков и формирование комплекса оболочечных гликопротеинов происходит правильно, неверно собранные белки Е1 и Е2, а также их комплексы обнаруживаются в цистернах ЭПР в виде высокомолекулярных агрегатов [105].

Под действием клеточных ферментов сети ЭПР белки Е1 и Е2 гликозилируются, образуя так называемый хитобиозный кор [97].

Процесс гликозилирования начинается одновременно с фолдингом белков и завершается в вакуолях аппарата Гольджи. Гликозилирование обеспечивает правильную пространственную укладку, формирование определенной антигенной структуры и появление биологической активности у оболочечных гликопротеинов. Кроме того, после гликозилирования белки Е1 и Е2 могут секретироваться из клеток и лучше защищены от некоторых протеолитических ферментов клетки.

Оба гликопротеина ВГС относятся к трансмембранным белкам I типа, для которых характерно наличие NН2-концевого эктодомена (так называют часть белка, экспонированную из липидного бислоя оболочки вируса) и СООН-концевого трансмембранного участка. В белках Е1 и Е2 обнаружены один–два трансмембранных тяжа, участвующие в формировании комплекса Е1–Е2 и удерживающие гликопротеины в липидном бислое оболочки вируса [106–108].

В последнее время большое внимание ученые уделяют поиску в оболочечных гликопротеинах ВГС пептида слияния (fusion peptide), который обеспечивает объединение липидных бислоев эндосомы и вируса. Для ВГС предложена модель (которая частично уже подтверждена) проникновения в клетку по аналогии с процессом, характерным для вируса клещевого энцефалита. Согласно этой модели, при контакте ВГС с рецептором образуется комплекс вирус-рецептор, который в виде эндоцитозной вакуоли проникает внутрь клетки (этот процесс еще называют рецепторопосредованный эндоцитоз). На следующем этапе эндоцитозная вакуоль сливается с эндосомой (цитоплазматической везикулярной структурой клетки), которая характеризуется низкими значениями рН. Под действием кислой среды эндосомы поверхностные гликопротеины ВГС претерпевают конформационные изменения, приводящие к экспонированию и внедрению пептида слияния в эндосомальную мембрану. Этот процесс запускает слияние липидного бислоя вируса и мембраны эндосомы, которое завершается выходом РНК ВГС в цитоплазму клетки.

До настоящего времени не установлено, в каком из двух гликопротеинов оболочки ВГС находится пептид слияния. Существует несколько предположений о его локализации в белке Е1: на участке с аминокислотными остатками 265–287, или 272–281, или 275–293 [107, 109]. Обнаружено сходство в первичной структуре предполагаемого пептида слияния ВГС подтипа 1а (ако 265–287) с аналогичными пептидами у некоторых представителей семейства Flaviviridae (рис. 6) [109].

В гликопротеине Е1 ВГС выявлено четыре участка N-гликозилирования: это аспарагиновые остатки в положениях 196, 209, 234 и 305 [110–112]. Применяя метод точечных мутаций в участке вирусной РНК, кодирующей белок Е1, удалось показать, что исчезновение сайтов гликозилирования в положении 209 и 234 не влияет на формирование комплекса Е1–Е2 [110, 113]. Олигосахаридные остатки

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 6. Первичная структура пептида слияния у отдельных представителей семейства Flaviviridae [109].

ВКЭ – вирус клещевого энцефалита, ВЖЛ – вирус желтой лихорадки, ВЯЭ – вирус японского энцефалита, ВДЕН – вирус денге, КУНВ – куньян вирус, ВЗН – вирус Западного Нила. Подчеркнуты общие с ВГС аминокислотные остатки (2 глициновых и 2 цистеиновых), курсивом выделены аминокислотные остатки, близкие по физико-химическим свойствам.

в положениях 196 и 305 нужны для правильной пространственной укладки белка Е1, а также для образования комплекса гликопротеинов Е1–Е2. Кроме того, показано, что углеводные остатки в положении 196 и 209 гликопротеина Е1 необходимы для сохранения инфекционности вируса [112].

На рис. 7 представлена гипотетическая модель пространственной укладки белка Е1, рассчитанная по данным протеомного анализа, компьютерного моделирования и сравнительного анализа с оболочечным белком Е вируса клещевого энцефалита.

Олигосахаридные цепи гликопротеинов ВГС сформированы чаще всего 6–9 остатками маннозы, присоединенными к двум остаткам N-ацетилглюкозамина [114, 115]. Только в белке Е2 обнаружен более сложный тип олигосахаридов с меньшим числом остатков маннозы, которую частично замещает фукоза, а остатки N-ацетилглюкозамина находятся в концевых положения олигосахаридной цепи [115].

В гликопротеине Е2 обнаружено 11 сайтов гликозилирования по аспарагиновым остаткам в положении 417 (1), 423 (2), 430 (3), 448 (4), 476 (5), 532 (6), 540 (7), 556 (8), 576 (9), 623 (10) и 645 (11) [111, 112, 115].

Показано, что комплекс гликопротеинов Е1–Е2 не образуется, если

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 7. Схема предполагаемой пространственной структуры белка Е1 представлена в легкой модификации из статьи R.F. Garry и S. Dash [107].

Условные обозначения: жгут – полипептидная цепь, цилиндры – альфа-спираль, стрелки – бета-структура, трезубцы – олигосахаридные цепи, черные отрезки – дисульфидные связи.

отсутствует олигосахаридная цепь в положении 10 белка Е2 ВГС.

Вирус теряет инфекционность, если в гликопротеине Е2 нет углеводных остатков в положениях 1, 2, 4, 8, 10 и 11 [111]. Кроме того, установлено, что олигосахаридные цепи в позициях 1, 6 и 11 участвуют в формировании эпитопов, на которых образуются вируснейтрализующие антитела [108, 116].

Обнаружено, что вирусы подтипа 1а и 3а различаются количеством олигосахаридных цепей в оболочечных белках [117]. В гликопротеине Е2, в отличие от белка Е1, есть модифицированные олигосахаридные остатки в положении 423 и 430 [115, 116].

Гликопротеин Е2 плохо поддается изучению физико-химическими методами анализа структуры белков, в основном из-за большого количества углеводных остатков. Обилие олигосахаридных цепей в гликопротеине Е2 затрудняет получение кристалла белка для рентгеноструктурного анализа и проведение ядерного магнитного резонанса. Поэтому была сделана модель вторичной структуры для укороченной формы (эктодомена) белка Е2 с помощью компьютерных программ, предсказывающих фолдинг белка, и сравнительного анализа уже изученных оболочечных белков семейства Flaviviridae [112]. Эктодомен представляет собой фрагмент гликопротеина Е2 (ако 384–660) без его трансмембранной части, который обладает многими биологическими свойствами, присущими полноразмерному белку Е2. Он может образовывать комплекс с гликопротеином Е1, взаимодействовать с моноклональными антителами к конформационным эпитопам белка Е2, а также с гепаринсульфатом и некоторыми клеточными рецепторами.

В этой пространственной модели эктодомена гликопротеина Е2, предложенной A.T. Yagnik и соавторами, выявлено низкое содержание элементов вторичной структуры (около 37%) и преобладание неупорядоченных участков [113]. Элементы вторичной структуры представлены в основном бета-складчатыми участками и несколькими короткими альфа-спиральными фрагментами. Это первая и пока единственная модель гликопротеина Е2, которая, очевидно, отображает его реальную вторичную структуру с некоторым приближением. В виду сложности и неоднозначности этой модели она наглядно не представлена.

Одной из главных особенностей первичной структуры белка Е2 является наличие участков с непостоянной аминокислотной последовательностью, которые называют вариабельными и гипервариабельными [118, 119]. В белке Е2 найдено три участка с очень высокой частотой аминокислотных замен, это гипервариабельные регионы (ГВР). Первый ГВР локализован в NН2-концевой части белка Е2 на участке с аминокислотными остатками 384–411, второй ГВР – на участке с остатками 474–482 и третий, обнаруженный недавно, – на участке с остатками 431–466 или 434–450 [120–122].

Установлено, что первый ГВР, несмотря на высокую частоту аминокислотных замен, всегда сохраняет суммарный положительный заряд и стабильный профиль гидрофильности/гидрофобности.

Кроме того, четыре его аминокислотных остатка в положениях 385, 389, 406 и 409 очень консервативны, т.е. они встречаются очень часто в изученных изолятах ВГС [123, 124]. Все многообразие вариантов аминокислотных последовательностей первого ГВР может быть сведено к консенсусной последовательности, которая составлена из наиболее часто встречающихся аминокислотных остатков в каждом из 27 положений (384–411) этого участка белка Е2 [124, 125]. Биологическая роль первого ГВР заключается в обеспечении начальных этапов сорбции ВГС на клеточной поверхности и в представлении иммунной системе «скользящей мишени», которую формируют постоянно меняющиеся новые антигенные варианты этого региона белка Е2 [31, 123, 126].

Существуют данные в пользу того, что второй и третий ГВР участвуют в связывании ВГС с клеточными рецепторами [121, 127].

Благодаря аминокислотной изменчивости всех трех гипервариабельных регионов гликопротеина Е2 формируются так называемые ускользающие варианты вируса, т.е. такие, на которые в данный момент нет иммунного ответа.

Еще одна особенность оболочечного белка Е2 – наличие участков полипептидной цепи, имеющих сходство с другими белками.

Это явление называют молекулярной мимикрией. Так, двенадцать консервативных аминокислотных остатков (положение 660–671) белка Е2 формируют РеPHD домен, идентичный участку фосфорилирования в рибосомальном факторе инициации трансляции eIF2a [128]. Благодаря этому сходству ВГС может останавливать антивирусное действие ИФН-альфа. Протеинкиназа R после активации интерфероном-альфа должна фосфорилировать фактор eIF2a, что в свою очередь приводит к остановке трансляции РНК ВГС. Но белок Е2, используя домен РеPHD, взаимодействует с протеинкиназой R вместо фактора eIF2a, и биосинтез вирусных белков продолжается [129].

В NН2-концевой части белка Е2 обнаружена молекулярная мимикрия с участками легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов и с Т-клеточным рецетором [118]. Предполагается, что это структурное сходство может быть причиной развития у инфицированных ВГС пациентов таких аутоиммунных нарушений, как смешанная криоглобулинемия II типа и В-клеточная неходжкинская лимфома [130].

Как уже упоминалось выше, оболочечные белки ВГС обеспечивают взаимодействие вируса с клеточными рецепторами. Установлено, что олигосахаридные остатки этих оболочечных гликопротеинов могут играть ключевую роль в связывании вируса с такими его потенциальными рецепторами, как DC-SIGN (CD209), L-SIGN (CD209L) и асиалогликопротеиновым рецептором [117, 131, 132]. Первые два потенциальных рецептора являются белками-лектинами типа С и функционируют как поверхностные адгезивные молекулы, обеспечивающие клеточные контакты между дендритными, эндотелиальными и Т-клетками. Рецепторы L-SIGN присутствуют на поверхности эндотелиальных клеток синусоидов печени и лимфатических узлов, а DC-SIGN – на поверхности дендритных клеток. В этих рецепторах имеется специальный кальций-зависимый углеводраспознающий участок CRD (carbohydrate recognition domains), который может связываться с углеводными остатками белков Е1 и Е2 [117, 131]. Поскольку рецепторы DC-SIGN и L-SIGN не обнаружены в гепатоцитах, они не могут рассматриваться как главные мишени ВГС. Эти рецепторы захватывают, накапливают вирус и передают его Т-клеткам и, возможно, гепатоцитам.

Асиалогликопротеиновый рецептор присутствует на поверхности клеток печени и обеспечивает проникновение в них гликопротеинов, не имеющих на конце углеводных цепей остатка сиаловой кислоты. С этим рецептором специфически связываются рекомбинантные белки Е1 и Е2, полученные при экспрессии соответствующих фрагментов РНК ВГС в клетках насекомых [132].

Установлено, что рекомбинантный белок Е2 взаимодействует с еще одним потенциальным вирусным рецептором (или корецептором) – трансмембранным белком CD81 [133]. Этот рецептор присутствует на поверхности большинства клеток (кроме эритро- и тромбоцитов) и участвует в клеточных функциях, связанных с адгезией, подвижностью, активацией метаболизма и трансформацией. CD81 относится к группе белков тетраспанинов и имеет характерную структуру: 4 трансмембранных тяжа и большую и малую внеклеточные петли. Показано, что большая внеклеточная петля CD81 специфически связывается с рекомбинантным вирусным белком Е2 [133].

Модель вируса гепатита с Прочитайте интересные книги о жизни…
Ценное знание …

В модели A.T. Yagnik и соавторов в этом взаимодействии участвуют две поверхностно расположенные зоны белка Е2 с ако 474–494 и 522–551 [112]. Однако в более позднем исследовании было установлено, что в контакт с большой петлей CD81 вступают аминокислотные остатки белка Е2 в позициях 420, 527, 530 и 535 [134].

Эксперименты с ВПЧ, ПВЧ и нативным вирусом из сыворотки крови больных ХГС подтвердили, что CD81 участвует в процессе проникновения ВГС в клетку, но кроме него нужен еще какой-то белок, стимулирующий эндоцитоз [77, 78, 134]. С помощью CD81 и этого белка в клетку будут проникать вирионы, не ассоциированные с липопротеинами, потому что нужен контакт вирусного гликопротеина Е2 и CD81. Известно, что содержание таких вирионов составляет около 20% (см. раздел 1.2). По этому пути в клетку могут проникать вирионы, не ассоциированные с липопротеинами, поскольку образование комплекса ВГС с ними, очевидно, препятствует контакту гликопротеина Е2 с рецептором CD81.

До 80% ВГС находится в организме инфицированных людей в виде комплекса с липопротеинами (это так называемые липовирусные частицы). Эти частицы проникают в клетки с помощью рецептора для ЛНП (см. раздел 1.2) и еще одного рецептора SR-BI (другое его обозначение Cla-1) [126]. Рецептор SR-BI обнаружен на поверхности многих клеток, но самое высокое его содержание отмечено в печени и стероидогенных тканях. Основная функция этого рецептора заключается в доставке в клетки липидов, входящих в состав липопротеинов высокой плотности. Рецептор SR-BI относится к трансмембранным белкам. Он имеет два мембранных тяжа, большую внеклеточную петлю и два коротких цитоплазматических участка в NН2- и СООН-концевых областях [135]. Установлено, что с этим рецептором может связываться первый ГВР рекомбинантного белка Е2, ПВЧ и вирус, полученный из культуры клеток [136–138]. Однако ВГС из сыворотки крови людей, больных гепатитом С, взаимодействует с рецептором SR-BI без участия первого ГВР и белка Е2 [118].

Для объяснения этого явления выдвинуто предположение о том, что вирус проникает в клетку, используя мультикомпонентный рецепторный комплекс, сформированный CD81 — SR-BI [77, 138].

Известно, что отрицательно заряженные углеводные цепи поверхностных гликопротеинов клетки могут служить центрами первичного связывания различных вирусов [139]. Благодаря этому процессу повышается содержание вируса на клеточной поверхности и вероятность его взаимодействия со специфическим рецептором возрастает. Эксперименты по связыванию ВГС с гепатомными клеточными культурами показали, что этот процесс может быть заблокирован гепарином и сурамином, имеющими отрицательный заряд [140]. Участок, с которым специфично связывается гепарин, предположительно локализован в первом ГВР гликопротеина Е2 и/или в зоне с ако 559–614, где выявлено высокое содержание положительно заряженных аминокислотных остатков [112, 126]. Однако в экспериментах с псевдовирусными частицами ВГС не удалось обнаружить взаимодействия белка Е2 с гепарином [141]. Очевидно, участие глюкозамингликанов в сложном процессе проникновения ВГС в клетку требует дальнейшего изучения.

Как показали исследования, выполненные в последнее десятилетие, ВГС обладает широким клеточным тропизмом. Вирус реплицируется в гепатоцитах, периферических и асцитных мононуклеарных клетках, лимфо- и моноцитах [142–144], дендритных клетках [52, 145], гематопоэтических клетках-предшественниках [146], микроглии [38], кардиомиоцитах [147], кишечном эпителии [148], остеобластах [149] и В-клеточных фолликулах лимфатических узлов [150]. Вероятно, поэтому для ВГС существует не один рецептор.

Большое внимание при изучении оболочечных белков уделяется анализу их антигенных и иммуногенных свойств, поскольку эти сведения необходимы для разработки вакцин против гепатита С.

Установлено, что гликопротеины Е1 и Е2 обладают высокой иммуногенностью. Так, при иммунизации шимпанзе рекомбинантными оболочечными белками были получены специфические антитела к этим белкам с титром 1/819200 [15]. Однако при естественном течении острого и хронического гепатита С у людей гуморальный ответ на вирусные гликопротеины Е1 и Е2 гораздо слабее.

Опубликованные данные по выявлению линейных В-эпитопов в белках Е1 и Е2 представлены в табл. 1. Для анализа этих эпитопов были использованы методы пептидного сканирования, фагового дисплея, а также моноклональные антитела. Метод пептидного сканирования основан на использовании синтетических пептидов, перекрывающих всю аминокислотную последовательность белка, и определении их иммунореактивности, т.е. способности взаимодействовать с антителами больных гепатитом С. Впервые такое исследование оболочечных белков ВГС было выполнено в корпорации Chiron (США) [151]. Позже, в 1997 г., были опубликованы результаты пептидного сканирования гликопротеинов Е1 и Е2, в котором

– &nbsp– &nbsp–

использовались уникальные сыворотки от женщин, инфицированных 17 лет назад единым изолятом ВГС, контаминировавшим лекарственный препарат анти-D иммуноглобулин [152].

Благодаря усилиям трех групп исследователей, возглавляемых J. Dubuisson, M. Flint и A.H. Patel, был создан банк мышиных и человеческих моноклональных антител (МКА) к ВГС, с помощью которых удалось определить некоторые линейные и конформационные В-эпитопы оболочечных белков Е1 и Е2 [79, 109, 153–155].

На рис. 8 представлена схема расположения В-эпитопов в гликопротеине Е2, выявленных с помощью МКА.

Особый интерес представляют В-эпитопы, связывание антител с которыми приводит к нейтрализации вируса. Такой вируснейтрализующий эпитоп был обнаружен в первом ГВР белка Е2 [156].

Еще один эпитоп, нейтрализующий связывание вируса с клеткой (так называемый NOB-эпитоп от «neutralization of binding»), имеет

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 8. Расположение В-эпитопов, выявленных с помощью МКА, в белке Е2.

Схема дана с легкими изменениями по публикациям R.F. Clayton и соавт. [79] и A.M. Owsianka и соавт. [155].

Вверху прямоугольниками отмечены МКА, распознающие эктодомен белка Е2, полноразмерный протеин Е2 в комплексе с белком Е1 и Е2 в составе ВПЧ. Внизу показаны МКА, взаимодействующие с эктодоменом белка Е2 или с полноразмерным протеином Е2 в комплексе с белком Е1. Черным цветом выделены МКА, ингибирующие связывание с CD81 эктодомена Е2, полноразмерного белка Е2 в комплексе с Е1 и ВПЧ. Серым цветом отмечены МКА, ингибирующие связывание ВПЧ с CD81.

конформационную структуру, в формировании которой, по предположению одной группы авторов, участвуют аминокислотные остатки из последовательности 406–644 белка Е2 [76, 156, 157], а, по мнению другой, – остатки из последовательностей 414–443 и 490–519 [158].

Показано, что еще один более сложный конформационный В-эпитоп, не обладающий вируснейтрализующими свойствами, может быть образован аминокислотными остатками из 3 участков:

297–306 белка Е1, 480–494 и 613–621 белка Е2 [167].

В гликопротеинах Е1 и Е2 выявлены Т-хелперные (CD4+) и Т-киллерные (CD8+) эпитопы (табл. 2).

В настоящее время исследования по локализации и структуре В- и T-эпитопов оболочечных белков ВГС продолжаются. Информацию на эту тему можно найти на интернет-сайте Национальной лаборатории Лос-Аламоса (США): http://hcv.lanl.gov.

– &nbsp– &nbsp–

* Eсли для определения эпитопа использовали 20-членные пептиды, то нет его точной локализации.

2.2. Нуклеокапсидный антиген Схема локализации нуклеокапсидного белка (синонимы: сердцевинный, кор) в полипротеине представлена на рис. 1. Этот белок участвует в важных этапах морфогенеза вируса: формирует вирусный нуклеокапсид, инициирует упаковку РНК ВГС и сборку оболочки вируса [74, 178, 179].

Вероятно, кор-протеин обладает и другими биологическими функциями. Так, в различных модельных экспериментах показано, что он взаимодействует с регуляторными белками и некоторыми структурными элементами клетки: с протеином р53 [179], первым рецептором для фактора некроза опухолей [180], рецептором лимфотоксина-бета [181], транскрипционным фактором LZIP [182], белком STAT3 (который усиливает сигнал транскрипции) [183], гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином К [184], хеликазой DDX3 [185], триглицеридными везикулами цитоплазмы [186], митохондриями [187], цитокератинами клетки [188]. Считается, что корбелок принимает участие в развитии стеатоза и гепатоканцерогенеза у больных ХГС [179, 186].

Нуклеокапсидный протеин образуется первым среди всех вирусных белков в процессе биосинтеза, он отщепляется от полипротеина с помощью сигнальных пептидаз клетки [190]. В заключительном протеолитическом гидролизе кор-белка участвует недавно открытая сигнальная пептид-пептидаза SPP, осуществляющая необычное внутримембранное расщепление [189, 190].

Процессинг нуклеокапсидного протеина сопровождается переходом его формы p23 (193 ако) в p21 (173 ако) и фосфорилированием по OH-группам сериновых остатков [189]. Отщепленный участок (174–193 ако) несет сигнал транслокации, благодаря которому NH2-концевая часть белка Е1 попадает внутрь цистерн ЭПР [191].

Созревшая форма кор-белка имеет хорошо выраженную амфипатическую структуру: гидрофильную NН2-концевую область и гидрофобный СООН-концевой участок [192]. Соответственно этому в белке выделяют домен D1 (гидрофильный) и домен D2 (гидрофобный). Подобное строение характерно для нуклеокапсидных белков семейства Flaviviridae. Иногда в кор-протеине выделяют еще и третий домен (центральный), имеющий необычно высокое содержание остатков триптофана [46].

В гидрофильном домене D1 находится участок связывания РНК, основные консервативные В-эпитопы и фрагмент, ответственный за формирование димера кор-белка [192]. Функционально активная форма нуклеокапсидного протеина образована двумя полипептидными цепями, т.е. кор-белок является димером, в котором преобладает альфа-спиральная структурная организация. В гидрофобном домене D2, который обеспечивает ассоциацию с мембранами и липидными включениями цитоплазмы, обнаружены амфипатические альфа-спирали с выраженными гидрофильными и гидрофобными поверхностями.

Среди всех вирусных белков кор-протеин отличается самым высоким содержанием консервативных зон в первичной структуре [193].

Схема расположения основных функционально важных участков нуклеокапсидного белка представлена на рис. 9. Кроме этих важных зон следует отметить область кор-протеина с аминокислотными остатками 72–91, которая взаимодействует с оболочечным белком Е1 [194], участок с остатками 69–104, необходимый для сохранения инфекционности у ВГС [195], зону с остатками 65–72, которая, вероятно, контактирует с пептидом р7 на ранних стадиях морфогенеза вируса [195].

По данным электронной микроскопии, сердцевинный белок локализуется в клетке на мембранах ЭПР, на липидных везикулах в цитоплазме, а также в ядре. Перенос кор-протеина в ядро клетки осуществляет клеточный транспортный белок бипарнин NLS, который при этом взаимодействует со специальной сигнальной последовательностью в сердцевинном белке [196].

Исследование нативных нуклеокапсидов из сыворотки крови и их аналогов, полученных с использованием репликонов ВГС, показало, что независимо от происхождения они имеют коэффициент седиментации около 100 S, плавучую плотность в градиен

– &nbsp– &nbsp–

Рис. 9. Схема расположения основных функционально важных участков в нуклеокапсидном белке дана с легкими изменениями из статьи C.L. Murray и соавт. [195].

Внизу цифрами отмечены номера аминокислотных остатков.

– &nbsp– &nbsp–

те цезия 1,28 г/мл и диаметр 33–46 нм, определенный с помощью трансмиссионного микроскопа [197, 198]. По данным электронномикроскопического анализа биоптатов печени людей с ХГС установлено, что размеры нуклеокапсидов вируса в этом случае колеблются более интенсивно: от 28 до 48 нм [198].

Сердцевинный белок является одним из наиболее иммуногенных антигенов ВГС. Данные о его В- и Т-эпитопах приведены в табл. 3 и 4.

Следует отметить, что В-эпитопы нуклеокапсидного белка сосредоточены в основном в гидрофильном домене и консервативных участках.

2.3. Характеристика белка NS2 Белок NS2 относится к неструктурным протеинам ВГС, он расположен в полипротеине после пептида р7 (см. рис. 1). Белок NS2 имеет молекулярную массу около 23 кДа, не содержит углеводных остатков и связан с мембранами ЭПР [206, 207]. Точная топография белка в мембране не установлена, предполагается, что он формирует 3 трансмембранных тяжа (см. рис. 5) [90]. Протеин NS2 плохо растворим, поэтому трудно поддается изучению.

Основная биологическая функция белка NS2 – выщепление сериновой протеазы ВГС. Для ее выполнения белок NS2 формирует комплекс с участком полипротеина, соответствующим белку NS3 [206, 208].

 



Источник: metodichka.x-pdf.ru


Добавить комментарий